透明质酸及其合成酶在炎症牙髓组织中的表达(2)

表1 HAS1、HAS2、HAS3、IL-6、IL-8、TNFα引物序列Tab.1 Primer sequences of HAS1, HAS2, HAS3, IL-6, IL-8, TNFα基因 正向引物 反向引物HAS1HAS2HAS3IL-6IL-8TNFαGAPDH5′-TCCAGGTGTGAGTCCAGCCA-3′5′-CACGATTGACCTTGCCTTGTAG-3′5′-GCATTGCCGCATACCAGGA-3′5′-AATGCCAGCCTGCTGACGAAG-3′5′-CGGAGCACTCCATAAGGCACAA-3′5′-CTGGAGAAGGGTGACCGACTCA-3′5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3′5′-ACCCAGAAGTCCCAGTCCCAAT-3′ 5′-TCTGCCTCACCATAATGCTGTT-3′5′-CAGCACCTCGTGGAAGATGT-3′5′-ACATTTGCCGAAGAGCCCTCAG-3′5′-CACGGCCAGCTTGGAAGTCAT-3′5′-GAGGCGTTTGGGAAGGTTGGAT-3′5′-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGTT-3′

2 结 果

2.1 HE染色

HE染色结果显示，与正常牙髓组织相比，炎症牙髓组织中出现组织炎症改变，如炎性细胞浸润、胶原纤维增厚、空泡变性、成牙本质细胞层排列紊乱甚至组织坏死(图1a,d)。

正常牙髓(a, b, c, g, h, i)；炎症牙髓(d, e, f, j, k, l)；HE(a, d)；TNFα(b, e)；HA(c, f)；HAS1(g, j)；HAS2(h, k)；HAS3(i, l)图1 TNFα、HA、HAS1、HAS2、HAS3在正常以及炎症牙髓组织中的HE及免疫组化染色(标尺：100 μm)Fig.1 The HE and IHC staining of TNFα, HA, HAS1, HAS2 and HAS3 in normal and inflamed dental pulp tissue(bar: 100 μm)

2.2 免疫组织化学染色

常规免疫组化染色结果提示，在正常牙髓组织中几乎无法检测到TNFα的表达，而在炎症牙髓组织中TNFα的表达明显强于正常牙髓组织。正常牙髓组织中可检测到HA以及HAS1、HAS2、HAS3的表达。在炎症牙髓组织中的HA、HAS2以及HAS3的表达比正常牙髓组织的表达明显(图1b, c, e, f, h, i, k, l)。HAS1在两种牙髓组织中的表达均较弱，无明显差异(图1g, j)。

免疫荧光染色结果提示，在炎症牙髓组织中TNFα、HA的表达均分别强于它们在正常牙髓组织中的表达，且TNFα和HA之间可见荧光共染色，即在TNFα表达增强的区域，透明质酸表达亦相应增强(图2a～h)，而HAS1在健康和炎症牙髓组织中的表达均较弱，其与TNFα在炎性牙髓组织中的表达不一致(图2i～p)；在TNFα表达增强的炎症牙髓组织区域，HAS2(图3a～h)和HAS3(图3i～p)表达也很明显，且HAS2的荧光染色信号比HAS3更强。

正常牙髓组织(a, b, c, d, i, j, k, l)；炎症牙髓组织(e, f, g, h, m, n, o, p)；DAPI(a, e, i, m)；TNFα(b, f, j, n)；HA(c, g)；HAS1(k, o)；TNFα/HA双标共染(d, h)；TNFα/HAS1双标共染(l, p)图2 TNFα和HA、TNFα和HAS1免疫荧光双标染色(标尺：100 μm)Fig.2 Double immunofluorescence staining of TNFα and HA, TNFα and HAS1(bar: 100 μm)

正常牙髓组织(a, b, c, d, i, j, k, l)；炎症牙髓组织(e, f, g, h, m, n, o, p)；DAPI(a, e, i, m)；TNFα(b, f, j, n)；HAS2(c, g)；HAS3(k, o)；TNFα/HAS2双标共染(d, h)；TNFα/HAS3双标共染(l, p)图3 TNFα和HAS2、TNFα和HAS3免疫荧光双标染色(标尺：100 μm)Fig.3 Double immunofluorescence staining of TNFα and HAS2, TNFα and HAS3(bar: 100 μm)

2.3 实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)

qRT-PCR结果和组织学染色结果一致，显示在炎症牙髓组织样本中,IL-6、IL-8、TNFα(PIL-6=0.000 017；PIL-8=0.000 016;PTNFα=0.000 589)的mRNA表达明显较正常牙髓组织有明显的增加(图4A)；与此同时，HAS2、HAS3(PHAS2=0.003 373;PHAS3=0.000 123)的mRNA表达量亦较正常牙髓有明显的增加。HAS1的表达量在炎症牙髓组织中较正常牙髓组织中稍有增加(P=0.025 232)(图4B)。P<0.05时认为差异有统计学意义。

A：正常及炎症牙髓组织中IL-6、IL-8、TNFα的mRNA的表达；B：正常及炎症牙髓组织中HAS1、HAS2、HAS3的mRNA表达*：P<0.05；**：P<0.01图4 炎症相关因子及透明质酸合成酶的qRT-PCR检测Fig.4 qRT-PCR of inflammatory factors and hyaluronic acid synthases

3 讨 论

牙髓是来源于外胚间充质的疏松结缔组织，位于由牙本质所形成的髓腔内，借狭窄的根尖孔与根尖周组织相连，由于缺乏足够的血液循环，因而极其脆弱。龋齿、牙外伤等都可引起牙髓组织感染性炎症，最终导致牙髓坏死甚至根尖周病变。牙髓组织在感染状态下引起炎症反应，释放各种炎症因子。炎症反应对感染状态下的牙髓组织而言是一把双刃剑，轻微的炎症可以刺激牙髓组织中的牙髓干细胞迁移到受伤部位，随后分化为成牙本质细胞并参与形成牙髓-牙本质复合体并产生修复性牙本质。严重的炎症引起不可逆的牙髓炎导致牙髓组织坏死[11]。透明质酸是牙髓组织中细胞外基质的重要成分，在维持细胞稳态、血管与细胞间的物质传递中发挥重要的功能，但有关透明质酸在牙髓组织炎症状态的表达以及作用至今仍不清楚。

本次实验通过HE染色观察到炎症牙髓组织样本组织学的改变，通过免疫组织化学实验检测到其中TNFα的免疫染色阳性表达结果、采用qRT-PCR 进一步验证了炎症因子IL-6、IL-8、TNFα在炎症牙髓组织样本中表达升高，以上结果均证明了所取牙髓组织的炎症状态，可用于后续的研究。研究结果同时表明在炎症牙髓组织中，HA、HAS2及HAS3的免疫染色强度较在正常牙髓组织中有明显增强，相关合成酶的mRNA表达亦较正常牙髓组织中明显升高，这些结果都进一步表明透明质酸可能参与牙髓组织炎症状态的调控。

文章来源：《牙体牙髓牙周病学杂志》 网址: http://www.ytysyzbxzzzz.cn/qikandaodu/2021/0707/471.html